體外哺乳類細(xì)胞基因突變（HGPRT）試驗(yàn)原理及注意事項(xiàng)
 In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test

【試驗(yàn)原理】
體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變試驗(yàn)是利用培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞作指示生物的體外遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)，可用于檢測有化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的基因突變，適用的細(xì)胞系包括小鼠淋巴瘤細(xì)胞（L5178Y），中國倉鼠肺細(xì)胞（V79），中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO），人類淋巴母細(xì)胞（TK6）等。這些細(xì)胞系，常用的遺傳學(xué)終點(diǎn)是檢測胸苷激酶（TK）圖標(biāo)，次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶（HPRT/HGPRT）圖標(biāo)，黃嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶（XPRT）基因突變。TK、HPRT/HGPRT、XPRT突變試驗(yàn)可以檢測不同的遺傳事件譜。
細(xì)胞在正常情況下，能產(chǎn)生HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶），在含有6-硫代鳥嘌呤（6-thioguanine,6-TG）的選擇性培養(yǎng)液中，HGPRT催化產(chǎn)生核苷-5^，-單磷酸（NMP），NMP摻入DNA中致細(xì)胞死亡。在致癌和（或）致突變物作用下，某些細(xì)胞X染色體上控制HGPRT的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變，不能再產(chǎn)生HGPRT， 從而使突變細(xì)胞對6-TG具有抗性作用，能夠在含有6-TG的選擇性培養(yǎng)液中存活生長。在有或無代謝活化系統(tǒng)的條件下，將細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于受試物中適當(dāng)時(shí)間，然后將細(xì)胞再傳代培養(yǎng)，在含有6-TG的選擇性培養(yǎng)液中，突變細(xì)胞會(huì)繼續(xù)分裂并形成集落，計(jì)數(shù)突變集落形成數(shù)，計(jì)算突變頻率，從而推斷受試物的致突變性。

【參考標(biāo)準(zhǔn)】
GB 15193.12-2014 體外哺乳類細(xì)胞HGPRT基因突變試驗(yàn)

【材料和試劑】
細(xì)胞：常用中國倉鼠肺細(xì)胞株（V79）和中國倉鼠卵巢細(xì)胞株（CHO），其他如小鼠淋巴瘤細(xì)胞株（L5178Y）和人類淋巴母細(xì)胞株（TK6）亦可。細(xì)胞在使用前應(yīng)進(jìn)行有無支原體污染的檢查。
培養(yǎng)液：應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)所用系統(tǒng)和細(xì)胞類型來選擇適宜的培養(yǎng)基。對于 V79和 CHO 細(xì)胞，常用-低必需培養(yǎng)基（MEM，Eagle）、改良 Eagle培養(yǎng)基（DMEM）加人10%胎牛血清和適量抗菌素。對于 TK6 和 L5178Y細(xì)胞，常用 RPMI 1640培養(yǎng)液，加人10%馬血清（培養(yǎng)瓶培養(yǎng)）或20%馬血清（96孔板培養(yǎng)）和適量抗菌素（青霉素、鏈霉素）。
胰蛋白酶/EDTA溶液：用無鈣、鎂 PBS配制，胰酶的濃度為0.05 %，EDTA 的濃度為0.02% ,胰蛋白酶與EDTA溶液按1:1混合。-20℃儲(chǔ)存。
活化系統(tǒng)：通常使用的是S9混合物。
選擇劑：6-硫代鳥嘌呤(6-TG)，建議使用終濃度為5μg/mL～15μg/mL,用碳酸氫鈉溶液(0.5 %)配制。
預(yù)處理培養(yǎng)液(THMG/THG)：為減少細(xì)胞的自發(fā)突變頻率，在試驗(yàn)前，先將細(xì)胞加在含 THMG的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，清除自發(fā)的突變細(xì)胞，然后再將細(xì)胞接種于THG(不含氨甲喋呤的THMG培養(yǎng)液)中培養(yǎng)1d～3d至細(xì)胞恢復(fù)正常生長周期和形態(tài)。
THMG 所含各物質(zhì)終濃度如下(除培養(yǎng)液成分外):
————胸苷，5×10^-6 mol/L；
————次黃嘌呤，5×10^-5 mol/L；
————氨甲喋呤，4×10^-7 mol/L；
————甘氨酸，1×10^-4 mol/L；

【試驗(yàn)方法】
一、受試物
受試物配制：固體受試物應(yīng)溶解或懸浮于適合的溶媒中，并稀釋至適當(dāng)濃度。液體受試物可直接使用或稀釋至適當(dāng)濃度。受試物應(yīng)在使用前現(xiàn)用現(xiàn)配，否則就必須證實(shí)貯存不影響其穩(wěn)定性。
溶媒的選擇：溶媒必須是非致突變物，不與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不影響細(xì)胞存活和S9活性。首-選溶媒是蒸餾水；對于不溶于水的受試物可選擇其他溶媒，首-選二甲基亞礬(DMSO)，但使用時(shí)濃度不應(yīng)大于0.5%。
對照：
每一項(xiàng)試驗(yàn)中，在有無代謝活化系統(tǒng)條件下均應(yīng)設(shè)陽性和陰性(溶媒)對照組。
 

• 陽性對照：當(dāng)使用代謝活化系統(tǒng)時(shí),陽性對照物必須是要求代謝活化、并能引起突變的物質(zhì)，可以使用3-甲基膽蒽(3-methylcholanthrene)、N-亞硝基二甲-胺(N-nitroso-dimethylamine)、7,12-二甲基苯并[a]蒽(7, 12-dimethylbenz[a]anthracene)等。在沒有代謝活化系統(tǒng)時(shí),陽性對照物可使用甲磺酸乙酯(ethyl methanesulphonate)、乙基亞-硝基-脲(ethylnitrosourea)等。也可使用其他適宜的陽性對照物。
• 陰性對照：陰性對照(包括溶媒對照)除不含受試物外，其他處理應(yīng)與受試物相同。此外，當(dāng)不具有實(shí)驗(yàn)室歷史資料證實(shí)所用溶媒無致突變作用和無其他有害作用時(shí)，還應(yīng)設(shè)空白對照。

二、劑量
-高濃度選擇：決定-高濃度的因素是細(xì)胞毒性、受試物在試驗(yàn)系統(tǒng)中的溶解度以及pH 或滲透壓的改變。
細(xì)胞毒性確定：應(yīng)使用指示細(xì)胞完整性和生長情況的指標(biāo)，在代謝活化系統(tǒng)存在和不存在兩種條件下確定細(xì)胞毒性，例如相對集落形成率或相對存活率。應(yīng)在預(yù)試驗(yàn)中確定細(xì)胞毒性和溶解度。
濃度設(shè)置和-高濃度選擇：至少應(yīng)設(shè)置4個(gè)可供分析的濃度。當(dāng)有細(xì)胞毒性時(shí)，其濃度范圍應(yīng)包括從大毒性至幾乎無毒性，通常濃度間隔系數(shù)在2～√10之間；如-高濃度是基于細(xì)胞毒性，那么該濃度組的細(xì)胞相對集落形成率或相對存活率應(yīng)為 10%～20 %(不低于10% )。對于那些細(xì)胞毒性很低的化合物，-高濃度應(yīng)是5μL/mL、5mg/mL或0.01mol/L。對于相對不溶解的物質(zhì)，其-高濃度應(yīng)達(dá)到或超過在細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)下的溶解度限值；-好在試驗(yàn)處理開始和結(jié)束時(shí)均評價(jià)溶解度，因?yàn)橛捎赟9等的存在，試驗(yàn)系統(tǒng)內(nèi)在暴露過程中溶解度可能發(fā)生變化，不溶解性可用肉眼鑒別，但沉淀不應(yīng)影響觀察。
三、試驗(yàn)步驟和觀察指標(biāo)
貼壁生長細(xì)胞的試驗(yàn)步驟和觀察指標(biāo)：

• 細(xì)胞準(zhǔn)備：將5×10⁵ 個(gè)細(xì)胞接種于直徑為10 mm平皿中，于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
• 接觸受試物：吸去培養(yǎng)液，PBS洗兩次，加人一定量的無血清培養(yǎng)液、一定濃度的受試物及S9混合物(無需代謝活化者用無血清培養(yǎng)液補(bǔ)足），置于培養(yǎng)箱中3h～6h，結(jié)束后吸去含受試物的培養(yǎng)液，用 PBS洗細(xì)胞兩次，換入含10%血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)19h～22 h。
• 表達(dá)：接觸受試物的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)19h～22 h后用胰酶-EDTA 消化，待細(xì)胞脫落后，加入含10%血清的培養(yǎng)液終止消化，混勻，放入離心管以800r/min～1000r/min的速度離心5min～7min，棄上清液，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，以5×10⁵ 個(gè)細(xì)胞接種于直徑為10 mm 的平皿，3d后傳代，仍接種5×10⁵個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)3d（-佳表達(dá)時(shí)間為6d～8d）。
• 細(xì)胞毒性測定：將上述*消化計(jì)數(shù)后的細(xì)胞每皿接種200個(gè)，每組5個(gè)皿，37℃、5二氧化碳條件下培養(yǎng)7d，固定，Giemsa染色，計(jì)數(shù)每皿集落數(shù)。
• 突變體的選擇及集落形成率的測定：表達(dá)結(jié)束后，消化細(xì)胞，分種，每組5個(gè)皿，每皿接種200個(gè)細(xì)胞，不加6-TG，7d后固定，Giemsa染色，統(tǒng)計(jì)每皿集落數(shù)，計(jì)算集落形成率。同時(shí)另做突變頻率測定，每組5個(gè)皿，每皿接種2×10⁵個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后加人6-TG（建議使用終濃度為5μg/mL～10μg/mL），放人培養(yǎng)箱培養(yǎng)8d～10d后固定，Giemsa染色，統(tǒng)計(jì)每皿集落數(shù)，并計(jì)算突變頻率。

懸浮生長細(xì)胞的試驗(yàn)步驟和觀察指標(biāo)：

• 細(xì)胞準(zhǔn)備及接觸受試物：取生長良好的細(xì)胞，調(diào)整密度為5×10⁵/mL，按1%體積加入一定濃度的受試物及S9混合物（無需代謝活化者用無血清培養(yǎng)液補(bǔ)足），37 ℃振搖處理3h～6h，以800r/min～1000r/min的速度離心4min～6min，棄上清液，用PBS或無血清培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，重新懸浮細(xì)胞于含10%馬血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，并調(diào)整細(xì)胞密度為2×10⁵/mL。
• PE₀（0天的平板接種效率）測定：取適量細(xì)胞懸液，作梯度稀釋至8個(gè)細(xì)胞/mL，接種96孔板（每孔加0.2mL，即平均1.6個(gè)細(xì)胞/孔），每個(gè)劑量接種1～2塊平板，37℃，5 二氧化碳，飽和濕度條件下培養(yǎng)9d～11d，計(jì)數(shù)每塊平板有集落生長的孔數(shù)。
• 表達(dá)：取上一步所得細(xì)胞懸液，作6d表達(dá)培養(yǎng)，每天計(jì)數(shù)細(xì)胞密度并保持密度在1×10⁶/mL以下。
• PE₆（第六天的平板接種效率）測定：表達(dá)培養(yǎng)結(jié)束后，取適量細(xì)胞懸液，按PE₀（0天的平板接種效率）測定方法測定PE₆。
• 突變頻率（MF）測定：表達(dá)培養(yǎng)結(jié)束后，取適量細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁵/mL，加人6-TG（建議使用終濃度為5μg/mL～15μg/mL），混勻，接種96孔板（每孔加0.2mL，即2×10⁴ 個(gè)細(xì)胞/孔），每個(gè)劑量接種2～4塊平板，37℃，5%二氧化碳，飽和濕度條件下培養(yǎng)11d～14d，計(jì)數(shù)有突變集落生長的孔數(shù)。

【數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評價(jià)】

• 數(shù)據(jù)處理

貼壁生長細(xì)胞 HGPRT試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理：
細(xì)胞毒性：以相對于溶媒對照組的集落形成率表示細(xì)胞毒性。即以溶媒對照的集落形成率為100%(1.00),求出各受試物組的相對值。
 

• 集落形成率和突變頻率：

 
懸浮生長細(xì)胞 HGPRT試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理：

• 平板接種效率(PE₀、PE₆)：

• 相對存活率（RS）：

• 突變頻率（MF）：

• 結(jié)果評價(jià)：
• 陽性結(jié)果的判定：

受試物組在任何一個(gè)劑量條件下的突變頻率為陰性（溶媒）對照組的3倍或3倍以上，可判定為陽性。
受試物組的突變頻率增加，與陰性（溶媒）對照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并有劑量-反應(yīng)趨勢，則可判定為陽性。
受試物組在任何一個(gè)劑量條件下引起具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加并有可重復(fù)性，則可判定為陽性。

• 陰性結(jié)果的判定：

不符合上述陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，則可判定為陰性。

【試驗(yàn)報(bào)告】

• 試驗(yàn)名稱、試驗(yàn)單位名稱和聯(lián)系-方式、報(bào)告編號。
• 試驗(yàn)委托單位名稱和聯(lián)系-方式、樣品受理日期。
• 試驗(yàn)開始和結(jié)束日期、試驗(yàn)項(xiàng)目負(fù)責(zé)人、試驗(yàn)單位技術(shù)負(fù)責(zé)人、簽發(fā)日期。
• 試驗(yàn)摘要。
• 受試物：名稱、鑒定資料、CAS編號（如已知）、純度、與本試驗(yàn)有關(guān)的受試物的物理和化學(xué)性質(zhì)及 穩(wěn)定性等。
• 溶媒和載體：溶媒和載體的選擇依據(jù)，受試物在溶媒和載體中的溶解性和穩(wěn)定性。
• 細(xì)胞株：名稱、來源、濃度及培養(yǎng)條件（包括培養(yǎng)基的組成、培養(yǎng)溫度、CO₂濃度和培養(yǎng)時(shí)間）。
• 試驗(yàn)條件：劑量、代謝活化系統(tǒng)、標(biāo)準(zhǔn)誘變劑、操作步驟等。
• 試驗(yàn)結(jié)果：各劑量組受試物（加和不加S9）對細(xì)胞的毒性和突變頻率的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差、是否具有劑量-反應(yīng)關(guān)系、統(tǒng)計(jì)結(jié)果，同時(shí)進(jìn)行的陰性（溶媒）對照和陽性對照的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差、以及陰性（溶媒）對照和陽性對照的歷史范圍。

結(jié)論：本試驗(yàn)條件下受試物是否具有致突變作用。

【試驗(yàn)解釋】
若陰性對照中，集落形成率或存活率低于50%，結(jié)果應(yīng)不采用。各實(shí)驗(yàn)室選用的陽性對照突變頻率有一定范圍，若受試物的結(jié)果為陰性或弱陽性時(shí)，陽性對照的誘變率應(yīng)達(dá)正常值的下限以上，否則結(jié)果不能成立。

HGPRT基因突變試劑盒
北京匯智泰康針對體外哺乳類細(xì)胞HGPRT基因突變試驗(yàn)開發(fā)HGPRT基因突變試劑盒，試劑盒提供了進(jìn)行體外哺乳類細(xì)胞HGPRT基因突變試驗(yàn)所需的主要試劑和細(xì)胞(V79)，可用于評價(jià)受試物的致突變作用。所用細(xì)胞和試劑均符合國標(biāo)GB 15193.12-2014 《食品安全-國家標(biāo)準(zhǔn) 體外哺乳類細(xì)胞HGPRT基因突變試驗(yàn)》的要求。
20mL×24體系/盒，4個(gè)劑量組。

【產(chǎn)品使用說明】
1、細(xì)胞復(fù)蘇
收到試劑盒后，請盡快復(fù)蘇細(xì)胞。
從-70℃冰箱中取出細(xì)胞，于37℃水浴融化，離心，棄上清，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸；再次離心，棄上清，用10% FBS培養(yǎng)基，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放置于37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，后期細(xì)胞傳代比例為1:3。
2、自發(fā)突變細(xì)胞清除
取對數(shù)生長期細(xì)胞懸液，于含1% （V/V）的THMG的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，離心，洗滌后將細(xì)胞接種于含1% （V/V）的THG（不含氨甲喋呤）培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)1d~3d，至細(xì)胞恢復(fù)正常生長周期和形態(tài)。
注：為確保試驗(yàn)的可行性，試驗(yàn)中所用細(xì)胞的自發(fā)突變率應(yīng)在5×10^-6~20×10^-6之間，清除自發(fā)突變的細(xì)胞傳代使用不得超過1個(gè)月，且每次試驗(yàn)前需將細(xì)胞清除自發(fā)突變。
3、染毒處理
將5×10⁵個(gè)細(xì)胞接種于直徑為100mm的平皿中，于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中放置培養(yǎng)24h。吸去培養(yǎng)液，PBS洗兩次，加入一定量的無血清培養(yǎng)液、一定濃度的受試物及10%S9混合液（無需代謝活化者用無血清培養(yǎng)液或S9反應(yīng)液PS補(bǔ)足），置于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~6h，結(jié)束后吸去含受試物的培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞兩次，換入含10%血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)19~22h，每個(gè)試驗(yàn)組平行處理兩份培養(yǎng)物。
（1）S9混合液及染毒用細(xì)胞液配制

注：在試驗(yàn)過程中，需根據(jù)實(shí)際需求，調(diào)整配制量。
（2）推薦染毒培養(yǎng)體系配制方案（試劑盒僅提供1次完整實(shí)驗(yàn)的4個(gè)劑量組所需）

注：1.染毒時(shí)間可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，一般為3h~6h，必要時(shí)可延長到1個(gè)或多個(gè)細(xì)胞周期。
2.如進(jìn)行短時(shí)間染毒，可直接加入稀釋并混合均勻的絲裂-霉素C；若進(jìn)行24h染毒，則需將絲裂-霉素C再稀釋2.5倍后再加入。
4、表達(dá)培養(yǎng)
接觸受試物的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)19~22h后，用胰酶-EDTA消化，待細(xì)胞脫落后，加入含10%血清的培養(yǎng)液終止消化，混勻，放入離心管中800r/min~1000r/min的速度離心5~7min，棄上清液，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，以5×10⁵個(gè)接種于直徑為100mm的平皿，3d后傳代，仍接種5×10⁵個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)3d（-佳表達(dá)時(shí)間為6d~8d）。
5、細(xì)胞毒性測定
將上述*消化計(jì)數(shù)后的細(xì)胞每皿接種200個(gè)，每組5個(gè)皿，37℃、5%的二氧化碳條件下培養(yǎng)7d，固定，Giemsa染色，計(jì)數(shù)每皿集落數(shù)。
以相對于溶媒對照組的集落形成率表示細(xì)胞毒性，即以溶媒對照的集落形成率為100%，求出各受試物組的相對值。計(jì)算公式見（1）：
A=B/C×100%------------------------------------------（1）
式中：A—相對集落形成率，%；B—受試物組集落形成率，%；C—溶媒對照組集落形成率，%。
6、突變體的選擇和集落形成率的測定
表達(dá)培養(yǎng)結(jié)束后，消化細(xì)胞，分種，每組5個(gè)皿，每皿接種200個(gè)細(xì)胞，不加6-TG，7d后固定，Giemsa染色，統(tǒng)計(jì)每皿集落數(shù)，計(jì)算集落形成率。同時(shí)另做突變頻率測定，每組5個(gè)皿，每皿接種2×10⁵個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，按照千分之一的比例加入6-TG，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8~10d后固定，Giemsa染色，統(tǒng)計(jì)每皿集落數(shù)，計(jì)算突變頻率。
集落形成率計(jì)算見式（2）：
D=E/F×100%-------------------------------------------（2）
式中：D—集落形成率，%；E—實(shí)際存活的細(xì)胞集落數(shù)；F—接種細(xì)胞數(shù)。
突變頻率計(jì)算見式（3）：

式中：G—突變頻率；H—突變集落數(shù)；I—接種細(xì)胞數(shù)；D—集落形成率。
7、結(jié)果評價(jià)
7.1 實(shí)驗(yàn)成立條件
若陰性對照中，集落形成率低于50%，結(jié)果應(yīng)不予采用。
若受試物的結(jié)果為陰性或弱陽性時(shí)，陽性對照的誘變率應(yīng)達(dá)正常值的下線以上，否則結(jié)果不成立。
7.2 結(jié)果判定
受試物組在任何一個(gè)劑量下的突變頻率為陰性（溶媒）對照組的3倍或3倍以上，可判定為陽性。
受試物組的突變頻率增加，與陰性（溶媒）對照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并有劑量-反應(yīng)趨勢，則可判定為陽性。
受試物組在任何一個(gè)劑量條件下引起具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加并有可重復(fù)性，則可判定為陽性。
不符合上述陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，則可判定為陰性。
【注意事項(xiàng)】
實(shí)驗(yàn)前請自行準(zhǔn)備胎牛血清、RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胰酶-EDTA、Giemsa染色液、100mm平皿、滅菌槍頭、無菌移液管、二氧化碳培養(yǎng)箱、振蕩器、50mL離心管等，所有耗材需做無菌處理。