1    概述

1.1 藥物代謝研究簡(jiǎn)介

藥物代謝研究是創(chuàng)新藥物研發(fā)的重要內(nèi)容，它不僅決定了創(chuàng)新藥物制劑研發(fā)的成敗，而且與創(chuàng)新藥物研發(fā)的速度和質(zhì)量有密切關(guān)系。因而，藥物代謝研究在新藥研發(fā)工程中具有*的重要作用，研究藥物代謝對(duì)于了解藥物在體內(nèi)的變化過(guò)程至關(guān)重要。

藥物代謝研究的方法主要分為體內(nèi)和體外兩種。體內(nèi)代謝法因藥物在生物體內(nèi)的分布較廣，加上代謝轉(zhuǎn)化的器官和酶系的多樣性，使藥物及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的濃度比較低，代謝產(chǎn)物的檢測(cè)具有一定的困難。體外代謝法在短時(shí)間內(nèi)可以得到大量的代謝產(chǎn)物，且代謝條件可控，代謝體系比較“干凈"，代謝物易于分離、提取，有利于代謝途徑研究及代謝產(chǎn)物結(jié)果的確定等，因而，體外代謝法具有突出的*性。

由于肝臟是藥物代謝的主要場(chǎng)所，體外代謝模型多以肝臟為基礎(chǔ)。目前，研究體外代謝方法主要有：肝微粒體體外溫孵法、重組P450酶體外溫孵法、肝細(xì)胞體外溫孵法、肝臟離體灌流法和肝切片法。其中，肝微粒體體外溫孵法與其他體外代謝方法相比，酶制備簡(jiǎn)單，代謝過(guò)程快，重現(xiàn)性好，易大量操作，同時(shí)可用于藥物代謝酶的抑制及體外清除等方面的研究，因而在實(shí)際工作中應(yīng)用較為普遍。

1.2 CYP450酶代謝表型研究的重要性

藥物代謝酶表型鑒定，主要是研究參與藥物清除的代謝酶的類(lèi)型、數(shù)量和相對(duì)貢獻(xiàn)率。如果藥物主要通過(guò)單一的代謝途徑對(duì)藥物進(jìn)行清除，可能會(huì)存在很大的用藥風(fēng)險(xiǎn)；相反，如果某一藥物的代謝過(guò)程涉及的代謝酶越多，則說(shuō)明其代謝途徑也越多，也就難以發(fā)生潛在的藥物-藥物相互作用，使得患者之間的治療偏差降低。因此，在新藥臨床前研究中，對(duì)藥物的代謝酶表型進(jìn)行鑒定，獲得其主要代謝酶的消除比例，闡明參與藥物體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化的相關(guān)酶亞型，對(duì)于研究藥物的代謝機(jī)制，預(yù)測(cè)藥物代謝多態(tài)性和藥物間相互作用等方面具有重要意義。

1.3 CYP450酶及代謝表型研究方法

CYP450為一類(lèi)含亞鐵血紅素蛋白的超家族，根據(jù)相關(guān)酶亞型在藥物代謝中的重要程度，可將CYP450分為以下三類(lèi)：（1）主要CYP450，包括CYP1A2、CYP2C9 、CYP2C19 、CYP2D6 和CYP3A4；（2）較主要CYP450，包括CYP2B6、CYP2C8和CYP3A5；（3）次要CYP450，包括CYP1A1、CYP1B1、CYP2A6、CYP2E1、CYP2J2和CYP4A11等。參與藥物代謝的動(dòng)物肝微粒體P450酶較為復(fù)雜，而人肝微粒體中參與藥物代謝的P450酶相對(duì)比較簡(jiǎn)單，主要有CYP1A、CYP2C、CYP2D、CYP2E和CYP3A，其組成見(jiàn)圖1。

圖1 人肝內(nèi)P450酶的組成

目前，CYP450的酶表型鑒定主要使用以下3種方法：選擇性抑制法、重組人源CYP450同工酶法、相關(guān)性分析法。選擇性抑制法又分為化學(xué)抑制法和抗體抑制法，即在加入和不加入一系類(lèi)CYP450酶亞型選擇性化學(xué)抑制劑或抗體的條件下，分別測(cè)定人肝微粒體對(duì)藥物的代謝活性，以考察人肝微粒體中CYP450酶亞型倍選擇性抑制后，藥物的代謝是否受到影響，從而計(jì)算相對(duì)抑制百分率，推斷CYP450酶代謝表型。其中，化學(xué)抑制法由于其操作簡(jiǎn)單，且價(jià)格低廉而得到廣泛應(yīng)用。

2    實(shí)驗(yàn)原理

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參與藥物代謝的CYP450酶主要為CYP1、CYP2和CYP3三個(gè)家族，其中CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4/5是主要的藥物代謝酶。CYP2B6和CYP2C19在體外沒(méi)有特異性的選擇性抑制可用，一般還需結(jié)合重組酶法進(jìn)行其表型確定。噻氯匹定是CYP2B6的抑制劑，諾卡酮是CYP2C19的抑制劑，α-奈黃酮為CYP1A2的特異的選擇性抑制劑，槲皮素為CYP2C8的特異的選擇性抑制劑，磺胺苯吡唑?yàn)镃YP2C9的特異的選擇性抑制劑，奎尼丁為CYP2D6的特異的選擇性抑制劑，酮康唑?yàn)镃YP3A4/5的特異的選擇性抑制劑，如選用特異的選擇性抑制劑抑制不同亞型的酶的活性，便可通過(guò)化學(xué)抑制法研究藥物的CYP450酶代謝表型。

3    實(shí)驗(yàn)方法描述

肝微粒體體外溫孵法是采用肝微粒體，輔以NADPH再生系統(tǒng)（IPHASE匯智和源），在體外模擬生理環(huán)境條件進(jìn)行代謝反應(yīng)，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的反應(yīng)后，采用HPLC、LC-MC和LC-MC/MC等測(cè)定溫孵液中原型藥物或其代謝產(chǎn)物的濃度，分析其主要代謝途徑。

3.1 肝微粒體制備

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P450酶主要在肝臟中表達(dá)，肝臟中的P450酶在體外是以微粒體的形式存在的。微粒體是指在細(xì)胞勻漿和差速離心過(guò)程中獲得的由破碎的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自我融合形成的近似球形的膜囊泡狀結(jié)構(gòu)，是異質(zhì)性的集合體。它包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核糖體兩種基本成分，在體外實(shí)驗(yàn)中具有蛋白質(zhì)合成、蛋白質(zhì)糖基化和脂類(lèi)合成等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的基本功能。目前，制備肝微粒體常用的方法是差速離心法。具體制備流程見(jiàn)下圖（圖2）：

圖2 肝微粒體制備流程圖

3.2 體外孵育體系的建立

CYP450酶代謝表型研究的肝微粒體體外孵育體系，是由制備的肝微粒體輔以氧化還原型輔酶，再加入酶特異的選擇性抑制劑，在模擬生理溫度及生理環(huán)境的條件下進(jìn)行生化反應(yīng)的體系。

推薦使用的孵育體系為：每個(gè)孵育體系總體積為200 µL，體系包括0.1M PH 7.4 的磷酸緩沖液，匯智和源NADPH再生系統(tǒng)（1mM NADP，5 mM的6-磷酸葡萄糖，1 U/mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶，3.3 mM的氯化鎂）；適當(dāng)濃度的肝微粒體蛋白；適量的選擇性抑制劑；合適濃度的待測(cè)物，于37°C水浴孵育，每個(gè)樣品平行3次，以不加選擇性抑制劑組為對(duì)照。于預(yù)設(shè)的反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，加入等體積預(yù)冷的乙腈終止反應(yīng)。

3.3 原型藥物或代謝產(chǎn)物的檢測(cè)

采用HPLC、LC-MC和LC-MC/MC等測(cè)定溫孵液中原型藥物或其代謝產(chǎn)物的濃度。

例：

下圖（圖3、圖4、圖5）為研究某一候選藥物的CYP450酶代謝表型的實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)采用選擇性化學(xué)抑制劑的方法分析了該藥物在鼠、犬和人肝微粒體中的代謝情況，從而判斷微粒體中哪些CYP450亞型是該藥物的主要代謝酶。

數(shù)據(jù)計(jì)算：

用待測(cè)物的消除速率表示待測(cè)物在微粒體孵育體系中的代謝速率。

抑制率%=（1- 加入抑制劑樣品代謝速率/空白對(duì)照樣品代謝速率）×100%

圖3 大鼠肝微粒中某藥物的代謝抑制率

圖4 犬肝微粒中某藥物的代謝抑制率

圖5 人肝微粒中某藥物的代謝抑制率

從上圖可知，不同種屬微粒體中，該候選藥物的代謝抑制率存在差異。表明，不同種屬微粒體中參與該候選藥物代謝的酶亞型可能不同。

4    CYP450酶代謝表型研究試劑盒簡(jiǎn)介

本公司針對(duì)CYP450酶代謝表型研究的需要，以肝微粒體體外溫孵法為指導(dǎo)，以化學(xué)抑制法為基礎(chǔ)，開(kāi)發(fā)了一款專(zhuān)門(mén)用于CYP450酶代謝表型研究的試劑盒，該產(chǎn)品可直接用于藥物CYP450酶代謝表型研究，省去了肝微粒體制備和試劑配制的繁瑣過(guò)程，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期，且試劑盒各組成成分經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，符合CYP450酶代謝表型研究試驗(yàn)要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好。

4.1 產(chǎn)品說(shuō)明

本產(chǎn)品提供了采用化學(xué)抑制法進(jìn)行CYP450酶代謝表型研究的所有試劑，可直接用于藥物CYP450酶代謝表型的研究，省去了試劑配制的繁瑣過(guò)程，且試劑盒各組成成分經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好。

根據(jù)微粒體種屬的不同，可根據(jù)實(shí)際需求選擇人肝微粒體、恒河猴肝微粒體、比格犬肝微粒體、大鼠肝微粒體和小鼠肝微粒體中的一種。

4.2 試劑盒優(yōu)勢(shì)

便捷——本試劑盒省去了肝微粒體制備和試劑配制時(shí)間，可以直接使用，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。

準(zhǔn)確——本試劑盒各成分均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性高。

穩(wěn)定——本試劑盒穩(wěn)定性強(qiáng)、易于運(yùn)輸和保存。

4.3 產(chǎn)品組成

50反應(yīng)/盒，200μL/反應(yīng)。

4.4 產(chǎn)品使用說(shuō)明

4.4.1 試驗(yàn)組

1）冰浴融化試劑盒各組分，置于冰上待用；

2）除微粒體外，將孵育體系其它各組分按照配比混合并吹吸混勻，于37℃預(yù)孵育5min；

3）將以上混合液195μL/管分裝至2.0mL離心管中，于37℃水浴中保溫， 5μL/反應(yīng)加入肝微粒體，吹吸3次混勻于37℃水浴條件下啟動(dòng)代謝反應(yīng)，使用秒表計(jì)時(shí)；

4）于設(shè)定孵育時(shí)間點(diǎn)，向孵育體系中加入終止液終止反應(yīng)（如預(yù)冷乙腈，預(yù)冷乙腈體積：孵育體系體積=1:1）。

例：200μL孵育體系配制：

注：a.體系中有機(jī)溶劑加入量不得大于1%；

b.若實(shí)際需要n個(gè)孵育體系，則需配置n＋1個(gè)體系。

4.4.2對(duì)照組：

1）陽(yáng)性底物組：反應(yīng)體系中不加選擇性抑制劑，并將受試物換為陽(yáng)性底物，其它組分加入量不變，缺少體積用0.1M PBS緩沖液補(bǔ)齊；

2）無(wú)抑制劑組：反應(yīng)體系中不加選擇性抑制劑，其它組分加入量不變，缺少體積用0.1M PBS緩沖液補(bǔ)齊；

無(wú)A、B液組：反應(yīng)體系中不加A液和B液，其它組分加入量不變，缺少體積用0.1M PBS緩沖液補(bǔ)齊。

4.4.3結(jié)果計(jì)算：

采用底物消除法評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果，用待測(cè)物的消除速率表示待測(cè)物在微粒體孵育體系中的代謝速率；

抑制率%=（1-加入抑制劑樣品代謝速率/無(wú)抑制劑組樣品代謝速率）×100%

4.5 使用注意事項(xiàng)

1）試驗(yàn)開(kāi)始前，請(qǐng)自行準(zhǔn)備2.0mL離心管、不同規(guī)格槍頭、37℃水浴鍋等；

2）本產(chǎn)品僅供科研使用，不能用于人體及動(dòng)物的治療或臨床診斷；

3）使用前，需于冰浴條件下解凍并混合均勻；

4）于-70℃冰箱冷凍保存，切勿反復(fù)凍融；

5）在使用過(guò)程中，也可根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整試劑盒使用方法和各組分的加入量；

6）因CYP2B6和CYP2C19在體外沒(méi)有絕對(duì)特異的抑制劑可用，故結(jié)果分析還需結(jié)合其它結(jié)果進(jìn)行，如重組酶法的結(jié)果。

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