關(guān)鍵詞：肝微粒體，藥物-藥物相互作用（Drug-drug interaction, DDI），細(xì)胞色素P450酶（CytochromeP450，CYP450），時間依賴性抑制（Time-dependent inhibition，TDI）

藥物-藥物相互作用（Drug-drug interaction, DDI）是臨床上產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)甚至死亡的主要原因之一，因此對DDI發(fā)生的可能性和嚴(yán)重性及其影響程度進(jìn)行科學(xué)評估是十分必要的。細(xì)胞色素P450酶（CytochromeP450，CYP450）是體內(nèi)重要的藥物代謝酶，其介導(dǎo)的藥物相互作用評估主要包括代謝表型研究、酶誘導(dǎo)作用評估及酶抑制作用評估。其中，藥物對于CYP450酶的抑制作用可分為可逆性抑制（Reversible Inhibition）和時間依賴性抑制（Time-dependent inhibition，TDI）。與可逆性抑制相比，TDI會帶來更嚴(yán)重的用藥安全問題，因此逐年受到監(jiān)管機(jī)構(gòu)及藥物研發(fā)者的重視。本期文章主要介紹CYP酶介導(dǎo)的時間依賴性抑制作用評估。

一、CYP酶介導(dǎo)的時間依賴性抑制介紹

CYP酶介導(dǎo)的酶抑制是指某些化合物能抑制某種或部分CYP450代謝酶的活性，導(dǎo)致聯(lián)合用藥時一些藥物出現(xiàn)代謝減慢、清除率降低及暴露量增加的現(xiàn)象，從而造成安全隱患。根據(jù)抑制的機(jī)制不同，藥物對于CYP450酶的抑制作用可分為可逆性抑制（Reversible Inhibition）和時間依賴性抑制（Time-dependent inhibition，TDI）。時間依賴性抑制又稱不可逆性抑制（Irreversible Inhibition），一般是指候選藥物經(jīng)CYP酶的代謝產(chǎn)物以共價(jià)鍵與酶形成復(fù)合物，導(dǎo)致酶不可逆性失活，抑制劑對酶的抑制效應(yīng)在除去抑制劑后不會即刻消失，而是呈現(xiàn)出時間依賴的特性。

與可逆性抑制相比，時間依賴抑制（TDI）的發(fā)生會帶來更為嚴(yán)重的用藥安全問題。聯(lián)合用藥的藥物如果受到TDI的影響，可能會存在暴露量非線性增長、血藥濃度大幅升高等后果，給患者帶來嚴(yán)重的健康威脅。最著名的實(shí)例莫如抗高血壓藥米貝拉地爾（mibefradil），它是一種鈣離子T和L通道阻滯劑，上市后出現(xiàn)了嚴(yán)重的不良反應(yīng)。最終經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，米貝拉地爾是一種時間依賴性的抑制劑，對CYP3A4產(chǎn)生不可逆性抑制，使聯(lián)合用的其他藥物血藥濃度大幅升高，以致產(chǎn)生毒性，甚至造成患者死亡，也因如此，米貝拉地爾不得不從市場上退出。

由此可見，TDI所造成的影響不僅給患者帶來嚴(yán)重的健康威脅，對制藥企業(yè)也是巨大的挑戰(zhàn)和威脅，因此逐年受到監(jiān)管機(jī)構(gòu)及藥物研發(fā)者的重視。《藥物相互作用研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》和ICH指導(dǎo)原則《M12：藥物相互作用》中明確表示應(yīng)進(jìn)行在研藥物對7種常規(guī)的CYP同工酶CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4 產(chǎn)生的可逆性抑制和時間依賴性抑制（Time-dependent inhibition，TDI）的體外試驗(yàn)評估。

二、時間依賴性抑制體外試驗(yàn)評估

一般采用人肝微粒體作為體外孵育系統(tǒng)進(jìn)行在研藥物對于CYP450酶的時間依賴性抑制評估研究。目前常規(guī)的TDI評估方法有Single-point法、IC50位移法（IC50 shift）和Kinact/Ki法。

【Single-point法】

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：一個或兩個試驗(yàn)濃度(通常1uM/10uM),一個探針底物濃度；+/-NADPH預(yù)孵育一個時間點(diǎn)；粗糙的評估，適合早期和高通量篩選。

評價(jià)參數(shù)：相對剩余活性（% Remaining activity=（% of NC(+NADPH）/% of NC(-NADPH）)×100

評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：相對剩余活性＜80%，提示有潛在的TDI風(fēng)險(xiǎn)

【IC50位移法（IC50 shift）】

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：系列試驗(yàn)濃度，一個探針底物濃度，+/-NADPH預(yù)孵育30min，以測定得到的IC50值進(jìn)行評估；相對精準(zhǔn)的評估，可用于進(jìn)行粗略的DDI預(yù)測。

評價(jià)參數(shù)：IC50位移=IC50（30min pre-incubation,-NADPH) /IC50（30min pre-incubation,+NADPH)

評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：IC50位移≥1.5，提示在研藥物存在TDI。

【Kinact/Ki法】

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：系列試驗(yàn)濃度，系列探針底物濃度，+/-NADPH預(yù)孵育多個時間點(diǎn)；精準(zhǔn)的測定手段，可用于進(jìn)行DDI的更精準(zhǔn)預(yù)測。

評價(jià)參數(shù)：Kinact/Ki

評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)合臨床PK數(shù)據(jù)，計(jì)算R2值評價(jià)臨床意義。

目前使用比較廣泛的評估TDI效應(yīng)的方法為IC50 位移法，即設(shè)置系列抑制劑濃度，在加和不加NADPH的情況下于37℃進(jìn)行預(yù)孵育，預(yù)孵育時間一般為30 min（也可以設(shè)置0min預(yù)孵育組作為對照）；預(yù)孵育后，加入含有NADPH的探針底物溶液，終止反應(yīng)后，測定孵育液中底物代謝產(chǎn)物的生成量，計(jì)算在0min預(yù)孵育和30min預(yù)孵育（加和不加NADPH情況下）IC50值，比較IC50位移倍數(shù)，從而評價(jià)抑制劑是否具有時間依賴性抑制作用。

三、IPHASE時間依賴性抑制試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

鑒于此，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，采用IC50位移法驗(yàn)證不同抑制劑對人肝微粒體CYP3A4酶的時間依賴性抑制（TDI）作用。IPHASE技術(shù)人員將預(yù)孵育時間設(shè)定為0min和30min，抑制劑濃度分別設(shè)置為0μM、0.0001μM、0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM。通過已知陽性底物睪酮被CYP3A4酶轉(zhuǎn)化為特異性代謝產(chǎn)物6β-羥基睪酮，利用液相-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測6β-羥基睪酮的生成量進(jìn)一步用于計(jì)算 IC50值。以下為結(jié)果數(shù)據(jù)分析：

1. 抑制劑無TDI作用

如圖所示，在30min預(yù)孵育后，NADPH（+）組的IC50=6.91μM，NADPH（-）組的IC50=8.76μM，IC50位移倍數(shù)=IC50(30 min princubation, -NADPH)/IC50(30 min princubation, +NADPH)=8.76/6.91=1.27 ＜1.5，且兩者相較于0 min孵育組的IC50值沒有明顯變化，表明在研藥物對于CYP3A4酶沒有TDI作用。

2.抑制劑為NADPH依賴的TDI

此圖可以明顯看出，在30min預(yù)孵育后，NADPH（+）組的IC50曲線較NADPH（-）組和0min預(yù)孵育組有明顯的左移，其IC50位移倍數(shù)=12.43/0.63=19.73＞1.5，但NADPH（-）組的IC50曲線和0min孵育組沒有明顯變化，說明在研藥物對于CYP3A4酶具有NADPH依賴的TDI作用。

3. 抑制劑為無NADPH依賴的TDI

在實(shí)際操作中，可能會遇到這樣一種情況：在30min預(yù)孵育后，NADPH（+）組的IC50曲線較NADPH（-）組并沒有明顯的左移，如上圖所示，IC50位移倍數(shù)=0.76/0.56=1.35＜1.5，似乎可以得出抑制劑對于CYP3A4酶沒有TDI作用的結(jié)論。但圖中可以明顯看到經(jīng)過30min預(yù)孵育時間的NADPH（+）組和NADPH（-）組的IC50曲線較0min預(yù)孵育組的IC50曲線有明顯的左移，說明抑制劑對于CYP3A4酶的抑制作用是呈時間依賴性的，但這種抑制作用并不依賴于NADPH，也就是說，在研藥物對于CYP3A4酶具有無NADPH依賴的TDI作用。

4. 抑制劑為NADPH依賴的酶代謝

第十四屆中國藥理學(xué)會藥物代謝專業(yè)委員會藥物和化學(xué)異物代謝學(xué)術(shù)會議,中國藥理學(xué)會藥物代謝專業(yè)委員會,藥物和化學(xué)異物代謝,化學(xué)異物代謝,藥物異物代謝

某次試驗(yàn)結(jié)束后，試驗(yàn)人員在統(tǒng)計(jì)結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，在30min預(yù)孵育后，NADPH（-）組的代謝情況和0min預(yù)孵育組的代謝情況基本一致，但NADPH（+）組的IC50曲線較0min預(yù)孵育組的IC50曲線發(fā)生了右移。針對這一“反常"情況，我們分析抑制劑對于CYP3A4酶是可逆性抑制作用，可以和底物與CYP3A4酶發(fā)生競爭性結(jié)合，并且在NADPH存在的情況下可能被微粒體中的某種酶代謝，其代謝產(chǎn)物并不會對CYP3A4酶產(chǎn)生抑制作用。抑制劑在NADPH存在的情況下經(jīng)過30min預(yù)孵育后，其代謝量較0min預(yù)孵育組多，原藥本身剩余量更少，對于CYP3A4酶的抑制作用較0min預(yù)孵育組弱，因此IC50值變大，其IC50曲線發(fā)生了右移。因此，我們判斷，在該組試驗(yàn)中，抑制劑可能發(fā)生了NADPH依賴的酶代謝。

5. 抑制劑為非NADPH依賴的酶代謝

如圖所示，在30min預(yù)孵育后，NADPH（-）組和NADPH（+）組的IC50曲線基本一致，但相比0min預(yù)孵育組的IC50曲線均發(fā)生了右移，該情況和上面第4種情況類似，抑制劑可能發(fā)生了酶代謝，但該代謝過程是不依賴于NADPH的。也就是說，在30min預(yù)孵育時，NADPH（-）組和NADPH（+）組的抑制劑均發(fā)生了酶代謝，且兩組間的代謝情況相似。在整個試驗(yàn)過程中，30min預(yù)孵育組的抑制劑較0min預(yù)孵育組酶代謝增多，對于CYP3A4酶的抑制作用減弱，因此IC50值變大，其IC50曲線發(fā)生了右移。因此，我們判斷，在該組試驗(yàn)中，抑制劑可能發(fā)生了非NADPH依賴的酶代謝。

四、IPHASE相關(guān)產(chǎn)品

藥物相互作用是新藥研發(fā)重要的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，而CYP酶介導(dǎo)的時間依賴性抑制作用評估是藥物相互作用評估重要的組成部分。鑒于此，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，憑借先進(jìn)的設(shè)備，專業(yè)的技術(shù)人員和多年研發(fā)的經(jīng)驗(yàn)，開發(fā)出人、猴、犬、大鼠、小鼠、豬、兔等多個種屬純度高、活性好的肝微粒體產(chǎn)品，助力廣大客戶進(jìn)行CYP酶介導(dǎo)的TDI及其他方向的研究。

IPHASE/匯智和源憑借多年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，推出了多領(lǐng)域、多種類的高-端科研試劑，為藥物早期研發(fā)提供篩選工具，為生命科學(xué)領(lǐng)域的探索提供新材料、新方法和新手段，為食品、藥品、化學(xué)品等的遺傳毒性研究提供便捷產(chǎn)品，望廣大科研工作者咨詢。

參考資料：

[1] 謝珊珊，王盼，郭建軍，等. 細(xì)胞色素P450酶的時間依賴性抑制研究及其在新藥研發(fā)中的作用[J]．中國新藥與臨床雜志，2013, 32(6): 419-425.

[2] ICH指導(dǎo)原則《M12：藥物相互作用》. 2024.

[3] NMPA. 藥物相互作用研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）.2021.

發(fā)    文    章    得    獎    勵

凡使用本公司產(chǎn)品，在國內(nèi)及國際刊物上發(fā)表論文（論文發(fā)表日起一年內(nèi)），并注明產(chǎn)品屬于我司所有，即可申請獎勵。根據(jù)發(fā)表刊物影響因子不同，給予不同金額獎品：

非SCI論文及IF≤5分，500元禮品；

5分＜IF≤8分 800元禮品；

8分＜IF≤10分 1000元禮品；

IF≥10分 2000元禮品；

我司標(biāo)準(zhǔn)信息如下

【中文簡稱】匯智和源

【中文全稱】匯智和源生物技術(shù)（蘇州）有限公司

【英文簡稱】iPHASE BIOSCIENCES

【英文全稱】iPHASE BIOSCIENCES Inc.

注：①禮品卡也可兌換同等金額產(chǎn)品購買抵用券；

    ②如遇我司公司名稱書寫不規(guī)范或不是第一作者等情況，對應(yīng)獎品將無法發(fā)放，敬請諒解！

關(guān)    于    我    們

匯智和源，致力于為創(chuàng)新藥研發(fā)企業(yè)及生命科學(xué)研究機(jī)構(gòu)提供高品質(zhì)的生物試劑，IPHASE為公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research"。